紫外分光光度計(jì)的工作原理主要基于朗伯-比爾定律(Lambert-Beer Law)。
 

　　當(dāng)一束紫外或可見(jiàn)光通過(guò)含有吸光物質(zhì)的均勻溶液時(shí)，部分光會(huì)被溶液中的吸光物質(zhì)所吸收，導(dǎo)致光強(qiáng)度減弱。

　　吸光物質(zhì)對(duì)光的吸收程度與溶液中吸光物質(zhì)的濃度、光通過(guò)溶液的路徑長(zhǎng)度(通常稱為光程)以及吸光物質(zhì)對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收系數(shù)有關(guān)。
 

　　具體來(lái)說(shuō)，入射光強(qiáng)度(I?)與透過(guò)光強(qiáng)度(I)之間的關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表示為：A = -log (I / I?) = ε × c × l ，其中 A 為吸光度，ε 為摩爾吸光系數(shù)(與物質(zhì)的性質(zhì)及入射光波長(zhǎng)有關(guān))，c 為溶液中吸光物質(zhì)的濃度，l 為光程。
 

　　在紫外分光光度計(jì)中，光源發(fā)出連續(xù)的紫外-可見(jiàn)光，經(jīng)過(guò)單色器分光，得到特定波長(zhǎng)的單色光，然后照射到裝有樣品溶液的比色皿中。檢測(cè)器測(cè)量透過(guò)樣品溶液后的光強(qiáng)度，并與入射光強(qiáng)度進(jìn)行比較，從而計(jì)算出吸光度。
 

　　通過(guò)改變?nèi)肷涔獾牟ㄩL(zhǎng)，并測(cè)量不同波長(zhǎng)下的吸光度，就可以得到物質(zhì)的吸收光譜。根據(jù)吸收光譜的特征峰位置和強(qiáng)度，可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。
 

　　例如，在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，由于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸在 280nm 波長(zhǎng)處有特定的吸收，通過(guò)測(cè)量該波長(zhǎng)下的吸光度，結(jié)合已知的摩爾吸光系數(shù)和光程，就可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度。